研究背景
自噬是細胞內一種通過雙層膜結構的自噬體包裹并降解細胞質成分(如錯誤折疊蛋白、損傷細胞器和入侵微生物)的降解途徑，對維持細胞穩態、細胞發育、免疫反應和細胞死亡至關重要，其失調與癌癥、糖尿病和神經退行性疾病相關。自噬體的形成由ATG蛋白調控，其中ATG16L1是關鍵蛋白，它與ATG12-ATG5結合形成復合物，催化LC3脂化，促進自噬體形成，并參與細胞內細菌隔離、線粒體自噬及炎癥調節。S-棕櫚酰化是一種可逆的翻譯后修飾，通過在半胱an酸殘基上添加棕櫚酰基團，影響蛋白質相互作用和膜結合，調節細胞信號傳導和蛋白功能。
本篇文獻“ZDHHC 7介導的ATG 16 L1的S-棕櫚酰化促進LC 3脂化和自噬體形成”，主要為了探索ATG16L1的S-棕櫚酰化位點及其對LC3脂化和自噬體形成的影響，以期闡明自噬調控機制。
研究內容
1. ATG16L1發生S-棕櫚酰化
首先，通過酰基生物su交換（ABE）實驗檢測ATG16L1的S-棕櫚酰化狀態，發現HEK293T細胞中的內源性ATG16L1以及MCF7細胞中過表達的ATG16L1均顯示出明顯的生物su信號，表明ATG16L1是一個S-棕櫚酰化蛋白。此外，使用棕櫚酰化抑制劑2-溴棕櫚酸(2-BP)處理細胞可顯著降低ATG16L1的修飾水平，進一步證實了其S-棕櫚酰化狀態。實驗還發現，自噬誘導(EBSS和Torin 1)可顯著增加ATG16L1的S-棕櫚酰化水平，而自噬抑制(VPS34-IN1)則降低其S-棕櫚酰化水平，表明ATG16L1的S-棕櫚酰化響應自噬信號。
2. ATG16L1的S-棕櫚酰化位點
為了確定ATG16L1的S-棕櫚酰化位點，研究者構建了多個截短突變體和位點突變體。通過ABE實驗，發現ATG16L1的Cys153是主要的S-棕櫚酰化位點。突變該位點(C153S)后，ATG16L1的S-棕櫚酰化水平顯著降低，表明Cys153是關鍵的修飾位點。
3. ATG16L1的S-棕櫚酰化對LC3脂化的影響
作者利用ATG16L1基因敲除(KO)HeLa細胞系，發現ATG16L1的缺失導致LC3-II的缺失，而重新表達野生型ATG16L1可恢復LC3-II的生成。然而，表達S-棕櫚酰化缺陷的ATG16L1-C153S突變體則無法恢復LC3-II的生成。在自噬誘導(EBSS或Baf-A1)條件下，野生型ATG16L1可顯著促進LC3-II的生成，而ATG16L1-C153S突變體則無法響應自噬誘導，表明ATG16L1的S-棕櫚酰化對LC3脂化過程至關重要。
4. ATG16L1的S-棕櫚酰化對自噬體形成的影響
通過在ATG16L1-KO HeLa細胞中穩定表達EGFP-LC3，并重新表達野生型ATG16L1或ATG16L1-C153S突變體，研究者發現野生型ATG16L1可顯著增加EGFP-LC3點狀結構(自噬體標記)的數量，而ATG16L1-C153S突變體則無法恢復自噬體的形成。進一步通過GFP-RFP-LC3雙熒光實驗和透射電子顯微鏡(TEM)觀察發現，野生型ATG16L1可促進自噬體和自噬溶酶體的形成，而ATG16L1-C153S突變體則無法促進這些結構的形成。此外，實驗還表明ATG16L1的S-棕櫚酰化缺陷不影響吞噬體的形成，但會抑制自噬體的成熟。
5. ZDHHC7介導ATG16L1的S-棕櫚酰化
接著，通過共免疫沉淀(Co-IP)實驗發現，ZDHHC7與ATG16L1相互作用，并且這種相互作用在自噬誘導條件下增強。進一步實驗表明，ZDHHC7過表達可顯著增加ATG16L1的S-棕櫚酰化水平，而ZDHHC7的催化活性位點突變體(ZDHHC7-C160S)則無法促進ATG16L1的S-棕櫚酰化。在ZDHHC7基因敲除(KO)細胞中，ATG16L1的S-棕櫚酰化水平顯著降低，而重新表達ZDHHC7可恢復ATG16L1的S-棕櫚酰化，表明ZDHHC7是ATG16L1 S-棕櫚酰化的關鍵酶。
6. ZDHHC7介導的ATG16L1 S-棕櫚酰化對自噬的影響
在ZDHHC7-KO細胞中，LC3-II的生成和自噬體的形成受到抑制，而重新表達ZDHHC7可恢復這些過程，而ZDHHC7-C160S突變體則無法恢復。此外，ZDHHC7過表達可促進LC3-II的生成和自噬體的形成，而ZDHHC7-KO則抑制這些過程。這些結果表明ZDHHC7介導的ATG16L1 S-棕櫚酰化在LC3脂化和自噬體形成中發揮重要作用。
7. ATG16L1的S-棕櫚酰化對其相互作用的影響
研究者發現，ATG16L1的S-棕櫚酰化對其與WIPI2B和RAB33B(WIPI2B通過招募ATG16L1復合物促進LC3脂化，而RAB33B則通過運輸ATG16L1復合物確保其在吞噬體上的定位)的相互作用具有顯著影響。野生型ATG16L1與WIPI2B和RAB33B的相互作用強于S-棕櫚酰化缺陷的ATG16L1-C153S突變體。此外，ZDHHC7過表達可增強ATG16L1與WIPI2B和RAB33B的相互作用，而2-BP處理則削弱這種相互作用。這些結果表明，ATG16L1的S-棕櫚酰化通過增強其與WIPI2B和RAB33B的相互作用，促進ATG16L1復合物在吞噬體上的募集，從而促進LC3脂化和自噬體的形成。
研究結論
本研究揭示了ZDHHC7介導的ATG16L1 S-棕櫚酰化通過增強其與WIPI2B和RAB33B的相互作用，促進LC3脂化和自噬體的形成，從而為自噬的調控提供了新的分子機制。
Wei F, Wang Y, Yao J, Mei L, Huang X, Kong H, Chen J, Chen X, Liu L, Wang Z, Wang J, Song J, Kong E, Yang A. ZDHHC7-mediated S-palmitoylation of ATG16L1 facilitates LC3 lipidation and autophagosome formation. Autophagy. 2024 Dec;20(12):2719-2737. doi: 10.1080/15548627.2024.2386915. Epub 2024 Aug 11. PMID: 39087410; PMCID: PMC11587844.
研究背景
2. ATG16L1的S-棕櫚酰化位點
3. ATG16L1的S-棕櫚酰化對LC3脂化的影響
4. ATG16L1的S-棕櫚酰化對自噬體形成的影響
5. ZDHHC7介導ATG16L1的S-棕櫚酰化
6. ZDHHC7介導的ATG16L1 S-棕櫚酰化對自噬的影響
7. ATG16L1的S-棕櫚酰化對其相互作用的影響
研究結論
Wei F, Wang Y, Yao J, Mei L, Huang X, Kong H, Chen J, Chen X, Liu L, Wang Z, Wang J, Song J, Kong E, Yang A. ZDHHC7-mediated S-palmitoylation of ATG16L1 facilitates LC3 lipidation and autophagosome formation. Autophagy. 2024 Dec;20(12):2719-2737. doi: 10.1080/15548627.2024.2386915. Epub 2024 Aug 11. PMID: 39087410; PMCID: PMC11587844.
