“MLKL-mtDNA-cGAS三體碰撞：炎癥宇宙大爆炸”

一、研究背景

壞死性凋亡（Necroptosis）是一種程序性細(xì)胞死亡方式，由RIPK3激酶磷酸化MLKL蛋白后引發(fā)，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂并釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，MLKL主要作用于細(xì)胞膜，誘導(dǎo)其破裂。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)MLKL也可定位于線粒體，但其功能尚不明確。此外，線粒體DNA（mtDNA）在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下可釋放至胞質(zhì)，激活cGAS-STING通路，誘導(dǎo)I型干擾素表達(dá)。本研究旨在探討MLKL是否通過介導(dǎo)mtDNA釋放，激活cGAS-STING通路，從而在壞死性凋亡中發(fā)揮促炎作用。

二、研究結(jié)果

1. 壞死性凋亡誘導(dǎo)cGAS-STING依賴的Ifnb表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，在L929細(xì)胞系中，誘導(dǎo)壞死性凋亡（如，使用TNF-α+Z-VAD-FMK）可顯著上調(diào)IFN-β（干擾素β）及其刺激基因（ISGs）的表達(dá)。該表達(dá)依賴于RIPK1、RIPK3和MLKL的完整性，且可被cGAS、STING或TBK1的敲除或抑制所阻斷，表明壞死性凋亡通過cGAS-STING通路誘導(dǎo)I型干擾素表達(dá)。

2. 壞死性凋亡誘導(dǎo)mtDNA釋放至胞質(zhì)

研究發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡誘導(dǎo)后，mtDNA顯著富集于胞質(zhì)中，而核DNA無明顯變化。該現(xiàn)象在多種細(xì)胞系中均可觀察到，且依賴于MLKL的存在。mtDNA釋放不伴隨其總量增加，提示其來源于線粒體的泄漏而非復(fù)制增強(qiáng)。

3. mtDNA是誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)的關(guān)鍵因子

通過使用mtDNA復(fù)制抑制劑（如ddC）構(gòu)建mtDNA缺失細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)即使細(xì)胞仍能發(fā)生壞死性凋亡，IFN-β的表達(dá)幾乎被抑制。這證實(shí)mtDNA是激活cGAS-STING通路、誘導(dǎo)干擾素表達(dá)的關(guān)鍵胞質(zhì)DNA來源。

4. mtDNA釋放不依賴傳統(tǒng)孔道機(jī)制（mPTP、Bax/Bak等）

研究排除了多種已知的mtDNA釋放機(jī)制，如線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）、電壓依賴性陰離子通道（VDAC）、Bax/Bak孔道等在壞死性凋亡中的作用。相關(guān)抑制劑或基因敲除均未影響mtDNA釋放，提示其機(jī)制與凋亡或焦亡不同。

5. 磷酸化MLKL介導(dǎo)線粒體膜穿孔與mtDNA釋放

通過免疫熒光、電鏡和線粒體分離實(shí)驗(yàn)，研究證實(shí)磷酸化MLKL可定位于線粒體外膜和內(nèi)膜，誘導(dǎo)膜結(jié)構(gòu)破壞并形成孔道，進(jìn)而介導(dǎo)mtDNA釋放。MLKL與心磷脂結(jié)合是其定位于線粒體的關(guān)鍵，PLSCR3（心磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）缺失可顯著減少mtDNA釋放和IFN-β表達(dá)。

6. 微管結(jié)構(gòu)完整性是mtDNA釋放的必要條件

研究發(fā)現(xiàn)，微管破壞劑（如秋水仙素Colchicine、小分子D-64131、長春新堿 Vincristine）可顯著抑制mtDNA釋放，而微管穩(wěn)定劑無此效應(yīng)。盡管微管破壞不影響MLKL向線粒體的轉(zhuǎn)位，但可能通過影響mtDNA與線粒體膜或MLKL孔道的相互作用，阻礙其釋放。

7. mtDNA-cGAS-STING通路參與壞死性凋亡相關(guān)腸炎模型

在Caspase-8缺失誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，研究發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞中磷酸化MLKL顯著上調(diào)，mtDNA釋放增加，IFN-β表達(dá)升高。使用STING抑制劑H-151可顯著減輕炎癥反應(yīng)、減少干擾素表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤，提示該通路在壞死性凋亡相關(guān)炎癥性疾病中具有重要作用。

三、研究結(jié)論

本研究系統(tǒng)闡明了壞死性凋亡過程中，磷酸化MLKL不僅破壞細(xì)胞膜，還可定位于線粒體，誘導(dǎo)mtDNA釋放至胞質(zhì)，激活cGAS-STING通路，從而以細(xì)胞自主方式誘導(dǎo)干擾素表達(dá)和炎癥反應(yīng)。該機(jī)制不依賴傳統(tǒng)孔道形成蛋白（如mPTP等），且需要微管結(jié)構(gòu)完整性。該發(fā)現(xiàn)為理解壞死性凋亡在炎癥性疾病中的作用提供了新機(jī)制，并為相關(guān)疾病（如炎癥性腸病）的治療提供了潛在靶點(diǎn)。

Ding Z, Wang R, Li Y, Wang X. MLKL activates the cGAS-STING pathway by releasing mitochondrial DNA upon necroptosis induction. Mol Cell. 2025 Jul 3;85(13):2610-2625.e5. doi: 10.1016/j.molcel.2025.06.005. PMID: 40614706.